文|胡一舸

编辑|胡一舸

前言

糖基转移酶广泛分布于天然生物中，它是一个巨大的基因家族，它的功能是催化糖基，将活性的供体分子转移到激素、次级代谢产物、蛋白等不同的小分子上。

从而影响受体的生物活性、稳定性、水溶性、转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别等性质。

尿核苷二磷酸糖基转移酶是植物中最主要的糖基供体，在植物的生长和发育过程中起着关键的调控作用。

最近，人们对UDP-glycoprotein进行了大量的研究，其中包括拟南芥，水稻，小麦，大豆，烟草等。在此基础上，深入探讨了其生理作用，如次生代谢，激素调控，生长发育等。

例如，UGT76C2与细胞分裂有关，在该基因的过表达植株中，细胞分裂素N-糖苷含量显著升高，而在沉默植株中则降低，这说明UGT76C2通过糖基化，对细胞生长和发育产生了影响。

超表达UGT73C5后，转基因植株中的油菜素内酯水平显著降低，而油菜素内酯水平显著提高，而UGT73C5则恰恰相反，表明UGT73C5可能是通过调节油菜素内酯水平，进而调节植物的生长发育。

然而，超表达UGT74E2却使植株产生了大量的生长激素，表现为植株生长迟缓、植株变矮等。UGT78D1能使槲皮素和山麻酚3-OH位发生糖基转移，从而影响黄酮类化合物的生物合成。

甘蔗是我国最主要的热带经济和最大的糖类原料，对中国和全球制糖工业都有很大的影响。蔗糖是一类重要的生物大分子，具有重要的生理功能。

为了进一步阐明这一重要的生理生化机制，我们从甘蔗的转录组测序结果中，获得了1个具有UDP-glycoprotease的UDP-glycoprotease，并对ShUGT2进行了亚细胞定位和蛋白质定位。

同时采用RT-PCR等方法对ShUGT2的时空表达模式进行了验证，以期为今后的蔗糖代谢调控网络的建立和完善奠定基础。

材料与方法

其所产的蔗糖来自中国热带农科院蔗糖研究所，而其所产的日本青则来自武汉伯远生物科技有限公司。

从北京全式金生物科技有限公司购买了DH5a的感受态电池，生工生化股份有限公司购买的质粒萃取测试盒和凝胶纯化和再生测试盒。

从TaKaRa购买了半定量的RT-PCR试剂，Taq酶，测序载体，cDNA合成试剂，从Omega购买了RNA抽取试剂，我们所供应的pCAM〜BIA1300-GFP载体。

以成熟的蔗苗ROC22为材料，按照试剂箱中的指示，从其叶片中抽取RNA，用琼脂凝胶电泳法对其进行分析。

发现其28S，18S，5S条带均为透明的，没有受到DNA的污染，结果表明，用UV法检测到的RNA含量符合下一步实验的要求（表1）。

按照TaKaRaCorporation的说明来进行cDNA第一条链的合成。在此基础上，以甘蔗的转录组资料为基础，对其进行了全基因组测序，并对其进行了PCR扩增。

其结果是：1μL的cDNA模板、12.5μL的2xTaq酶、ShUGT2-F1μL的引物、ShUGT2-R1μL的引物以及9.5μL的ddH2O，共计25μL的PCR扩增。

反应时间为95℃，7分钟，95℃1分钟，57℃1分钟，72℃2分钟，30个周期，72℃10分钟，30次。

对扩增后的PCR结果进行了初步鉴定，并对扩增后的PCR序列进行了剪裁，并将剪裁后的PCR序列与pMD19-T进行了比较。

转化DH5α受体细胞后，经PCR检测，结果为阳性克隆，对检测到的阳性细菌进行了序列测定，并送交上海生工科技股份有限公司对其进行序列测定。

采用shUGT2-L-F、ShUGT2-L-R作为pMD19-T基因表达的同源引物，对pMD19-T基因进行PCR扩增，并通过剪切胶水提取目标基因。

将pCAM-BIA1300-GFP表达质粒，用限制性内切酶KpnI对质粒进行了线形切割，采用DNA修复工具对酶解产物进行分离纯化。

将目标基因与线粒体克隆基团相连，在37℃下浸泡30分钟，接著立刻冰水浴5分钟，转移至DH5α受体的细胞内，经PCR证实为阳性的无性系，并以此无性系为试管，以试管抽提其质粒。

选择成熟的日本晴稻种，将其切成约0.2毫米，将其放入10毫升酶解溶液中，在暗真空条件下30分钟，以50r/分钟酶解4小时。

将W5等量的水加到120目的细胞仪中，然后用120目的细胞仪筛选，200r/分钟离心3分钟，除去上清液。

用1mLW5溶液清洗该原生质体，然后用200r/分钟的速度离心3分钟，取上清液，加1mL甲基丙烯酸甲酯的水，再悬浮于黑暗处。

在2毫升的离心试管中吸取10μL的质粒DNA，然后慢慢地添加100μL的原生质体悬液，混合均匀。

添加110微升40%聚乙二醇，在暗处进行15分钟的转染，添加400μLW5，用120r/min的离心法结束转染2分钟。

取其上清液，加1mLWI，在黑暗中培育12小时。与上述相同的操作步骤为pCAMBIA1300-GFP。采用共焦激光显微镜对其进行了分析。

根据Omega公司的工具箱要求，从成熟的甘蔗根、茎和叶组织中抽取RNA，并进行RT-PCR，制备cDNA。

以目标基因cDNA序列为基础，以GAPDH为内参考基因，设置了ShUGT2-YF、ShUGT2-Y-R（图1)，上海生工BET技术公司进行了引物序列测定及合成。

以cDNA为模板，采用95℃下5分钟的PCR方法对其进行了扩增，PCR扩增反应的PCR反应产物，以2%的琼脂凝胶电泳法进行PCR反应，并以数字胶片成像技术进行照片处理。

甘蔗基因ShUGT2的克隆及序列分析

提取PCR反应蛋白，与pMD19-T基因重组，经测序，得到全长1867bp的基因片段。通过对ShUGT2的基因进行了序列分析，结果显示，ShUGT2包含1782bp的一个完全的打开读码框，它的编码是593个氨基酸。

通过比较不同的氨基酸（如图2）以及建立的系统进化树（如图3）可以看出，ShUGT2与高粱的SbUGT2、玉米的ZmUGT2、谷子的SitUGT2、狗尾草的SvUGT2等基因的序列相似度很高，尤其是与高粱的SbUGT2基因的同源性最高，达92.45%。

根据对ShUGT2的物理化学特性的分析，可以看出，ShUGT2编码的蛋白质的理论等电点（pI）是8.16，相对分子量是67.28kDa，不稳定系数是48.68，属于一种不稳定的蛋白质，其疏水性指数是-0.338，因此可以推测出它是一种亲水性蛋白质。

其中含有丰富的精氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，阿司匹林和甘氨酸。对其进行了跨膜区域分析，结果表明其存在20-42个氨基酸之间的1个跨膜区域（见图4）。

对ShUGT2蛋白进行了氨基酸序列的比较研究，发现该蛋白含有一个含有UDP-glycoprotease的特殊区域（见图5）。

对其进行了二级结构解析，发现其具有alpha型螺旋，beta型角度，以及随机折叠等特征。

在这些序列中，构成alpha-螺旋的氨基酸有265个，占比44.69%，构成延伸的氨基酸有84个，占比14.17%，形成beta型的氨基酸有30个，比例为5.06%。

呈不规则螺旋状的氨基酸214个，比例为36.09%（见图6)，利用同源性模建，获得了这种氨基酸产品的三维立体图形（图7）。

在细菌溶液PCR（图8）证实为阳性的克隆后，采用同源重组技术，从细菌溶液中分离出pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP质粒，并利用激光共聚焦显微镜对其进行了检测。

我们发现，对照pCAMBIA1300-GFP空白载体在原生质体内各部分均有表达（图9-a)，而pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP融合载体，在线粒体上呈绿光并有显著的位置特点（图9-b)，由此推断ShUGT2所编码的蛋白质为一种线粒体蛋白质。

以ROC22号为材料，采用半定量RT-PCR技术，对其在甘蔗中的表达特征进行了研究（图10）。ShUGT2基因在甘蔗茎、叶和根中都有过高的表达，但是其基因的特异性在甘蔗中并不显著。

结论

UDP-glycoprotein对细胞的生长和发育起着非常关键的调控作用。我们前期已从甘蔗中获得一个具有UDP-glycoprotease的ShUGT2，并对其进行了初步的表观遗传学分析。

然而，GT8基因与木聚糖的生物合成密切相关，一旦丢失了木聚糖，植株就等同于丧失了二次生长的能力，导致植株变矮、不能进行抽苔。

而适量增加木聚糖的合成可以促使二次细胞壁的生成，从而增强植株的支撑力，增强植株的生长发育。

以拟南芥糖基转移酶GUX1/2为代表，能够将葡萄糖醛酸键合至木聚糖的主链处，并在其代谢途径中起着重要作用。

在对其进行的功能分析中，我们发现：亚细胞定位和其功能密切相关，这些蛋白在细胞内分布的位置各不相同，其作用也各不相同。

在此基础上，通过GFP和原生质体的瞬时表达，确定ShUGT2基因的亚细胞定位。我们的研究发现，PI3K/Akt在线粒体中起着重要的作用。

而在细胞分化、凋亡、离子平衡和细胞生长和能量代谢等方面，线粒体起着非常关键的作用。

由此推测，ShUGT2很有可能在线粒体中，通过影响木聚糖的生物合成，调节胞内半纤维组分和二次壁的生成，进而影响细胞的生长发育。

通过RT-PCR分析，我们发现ShUGT2基因在甘蔗根部、茎部和叶片中都有较高的表达量。

为此，本项目拟通过对不同组织器官、不同生长发育时期以及不同影响因子下ShUGT2的表达专一性进行进一步研究。为深入解析其生物学功能奠定了基础。

参考文献：

［1］徐孟亮，李落叶，陈荣军，等《一个新的水稻低温应答类糖基转移酶基因（OsCrGtI）的表达分析与克隆》

［2］林凡云，陆琼娴，徐剑宏，等《两个与盐和赤霉病菌胁迫相关的小麦糖基转移酶基因的克隆与表达》

［3］钟晓武，付强，邹颉，等《烟草糖基转移酶基因Nt‐GT5a的克隆及原核表达》

［4］徐超华，李纯佳，苏火生，等《甘蔗非生物胁迫抗性研究进展》