文 |大可天汉

编辑 |大可天汉

引言

黄萎病是由土传真菌黄萎病链格孢菌引起的，这一种严重破坏橄榄栽培的疾病，对全球橄榄产业造成了严重影响。这种病害给作物带来的后果从受影响枝条上部分产量损失到整棵树的完全毁灭不等。

多种促进因素解释了控制这种病害的困难。实施综合管理策略是应对这种血管病原体的最佳方法。在这一方法的指导下，使用耐黄萎病的品种是减轻VWO严重程度和传播的可持续和经济可行的措施。

在过去几十年里，关于筛选、评估和育种新的对VWO具有耐受性的基因型/品种的知识积累了很多。然而，到目前为止，尚未报道任何一种橄榄品种对VWO完全抵抗。

植物的耐受性由构造性和诱导性防御机制的组合确定。在黄萎病的情况下，多项研究表明，对V. dahliae的首要防御机制发生在根部。橄榄根部的基础防御与根系形态/结构以及根细胞壁组成有关。

之前的研究显示特定的根部结构特征增加了橄榄植物对V. dahliae的耐受性。此外，根细胞壁中的亚沥青质和木质素层,是阻止土传病原体进入的重要机械防御屏障。

细胞壁的其他成分，如酚类化合物和少量五环三萜类化合物，也贡献于植物的防御，二者均被归类为植物次生代谢产物。它们可能同时起着防御和信号化合物的作用，同时还能抵御紫外线辐射和氧化剂。

由于其抗氧化、抗微生物、抗真菌、抗病毒和抗炎活性，大多数对这些化合物的研究与其药理活性和治疗意义相关。关于橄榄植物，有关五环三萜类化合物的研究仅限于叶片和果实组织，以及在橄榄发育过程中这些化合物的变化研究。

酚类化合物是植物中最常见和广泛存在的物质之一。它们是来源于植物的香豆酸-苯丙氨酸-黄酮类代谢途径的次生代谢产物，产生单体酚和多聚酚。它们包括苦草苷类、简单酚、酚酸、黄酮类和木脂素。

植物酚可以分为两类：预形成酚，在植物组织正常发育过程中合成；诱导酚，由植物在受到物理损伤、感染或应对激发物时产生的。

研究表明，预形成的酚和多酚以非活性结合形式储存在植物细胞中，可以在植物水解酶的作用下迅速转化为生物活性抗生素，以应对病原体的攻击。

如果预先存在的抗微生物酚不足以阻止感染过程的发展，植物细胞通常会通过增加感染部位上这些化合物的水平来响应，从而抑制参与细胞壁降解的病原体酶。

此外，酚类化合物水平的增加为多酚氧化酶和过氧化物酶催化的氧化反应提供了适当的底物，通过消耗氧气并产生具有抗真菌作用的醌类化合物，使培养基对病原体的进一步发展不利。

诱导酚类化合物的合成可能也以原构型进行合成，然而，在生物或非生物胁迫下，它们的合成通常会得到提升。事实上，如果基础防御被克服，由植物病原微生物产生的诱导物，会在宿主植物的细胞中引发一系列防御反应。

关于橄榄植物，对酚类化合物的研究主要集中在它们的抗氧化和感官特性上，大部分是针对橄榄油、果实和叶片。关于橄榄根部的酚类成分的了解非常有限。在Picual品种的根部中报道了油果苷和羟基酪酸浓度在橄榄成熟过程中显著降低的情况。

Mechri等人还研究了水分亏缺条件下的橄榄根部酚类组成，他们报告称受水分胁迫的植物根部富含总酚类化合物，其中以油果苷为主要化合物。Skodra等人发现在盐分胁迫条件下，根部中羟基酪酸酯、香草醛和乙酰氧基非尼雷醇等酚类化合物浓度降低。

关于橄榄根部酚类化合物在防御机制中的作用，我们的知识也非常有限，特别是对于黄萎病菌这种情况而言。先前的研究显示，橄榄植株在受到黄萎病菌感染时，茎部中的酚类化合物迅速积累，从而限制或减缓病原菌的生长。

研究人员还测试了八种不同酚类化合物对黄萎病菌的抗真菌活性，结果显示芦丁、油果苷和芹菜素-7-葡萄糖苷是最具毒性的代谢物。报道了橄榄根组织中黄萎病菌DNA含量与总酚类和油果苷含量之间的负相关关系。

目前尚无有关橄榄根代谢谱与对黄萎病菌的耐受性/易感性之间的关系的信息。大部分关于橄榄根部次生代谢物在防御机制中的作用的研究，集中于利用高效液相色谱分析，来检测通常存在于橄榄油或果实中的特定化合物。

这种定向分析不能对橄榄根部的代谢谱进行广泛覆盖。迄今为止，只有一项关于橄榄根部全面代谢组学分析的研究可供参考。在这项研究中，作者利用液相色谱-高分辨质谱联用对科罗尼基和切图伊品种的不同植物器官进行了定性表征。

材料和方法

液相色谱流动相采用西格玛-奥尔德里奇系统产生的去离子水、普罗拉博购买的LC-MS级乙腈和西格玛-奥尔德里奇的醋酸制备而成。梯度纯度的乙醇用于提取分析物，由普罗拉博供应。

酪醇、羟基酪酚、忍冬苷、油橄榄苷、石楠酸、齐墩果酸和木犀草酸的分析标准品由西格玛-奥尔德里奇获得。油橄榄苷脱糖苷和木犀草苷的标准品由多伦多研究化学提供。

纯标准品的储备溶液以乙醇/水的形式制备，并逐级稀释以覆盖外部定标曲线的浓度范围，浓度范围为0.1至500 mg/L。所有的标准品和样品均通过0.22 μm尼龙注射器过滤器过滤，并在-20°C的暗瓶中储存，直到分析为止。流动相通过0.45 μm尼龙膜过滤器过滤。

研究使用在西班牙南部科尔多瓦省的商业苗圃购买的自根橄榄植株。其中三个品种被归类为对VWO具有耐受性，而另外三个品种被报告为对V. dahliae敏感。这组植物被用于平行的生物测定，以确定接种V. dahliae后根部的木质素含量。

在接种该病原体之前，将植株在温室中保持两个月，以使其适应Cardoni和其同事描述的光照、温度和相对湿度的实验条件。然后，每个品种接种V. dahliae V937I的植株数为12个。接种时，向每个盆中加入150 mL的孢子悬浮液。

这些孢子是通过将V937I在马铃薯葡萄糖培养基中，经过黑暗中以27°C恒温摇床培养7天后，通过无菌纱布过滤得到的。另外还有90株植物仅用150 mL自来水浇灌，并作为对照组。在接种后的时间点0、1、2、7和15天，对每个品种的六株植株进行取样。

每株植物的根部被拔起，在自来水下轻轻清洗后，迅速冷冻在液氮中，并在-80°C保存，待进一步处理。此外，每个品种还保留了7株接种V. dahliae和3株对照植株，在相同的温室条件下保持至100天后，以评估病害发展的差异。这方面的结果已经早些时候报道过。

每个根部样品被冷冻干燥并在一个50毫升不锈钢磨碗中与两颗钨珠一起使用MM 301搅拌磨机研磨成细粉。为了从根部基质中提取尽可能多的化合物，采用了固液萃取的方法。将根组织粉末称入锥形离心管中，并与5毫升EtOH/H2O混合溶液一起涡旋2分钟。

在使用超声波辅助释放代谢物从根组织中的过程中，将离心管在8500转/分的速度离心6分钟。这些步骤重复两次，第一次使用EtOH/H2O作为提取剂，最后一次使用纯EtOH。所有上清液被结合起来，通过尼龙膜过滤器过滤，并储存在-20°C下待使用。

进行样品分析使用了两台LC-MS系统：一台Waters Acquity UPLC H–Class系统与一台Q-TOF SYNAPT G2质谱仪耦合，用于定性分析；另一台Agilent 1260 LC系统与一台Bruker Daltonics Esquire 2000 IT质谱仪耦合，用于目标分析物的定量。

在两种情况下，代谢物的分离在40°C下在Zorbax Extend C18柱上进行，按照之前描述的程序进行。以酸化水和酸化乙腈为移动相梯度，在流速为1 mL/min的条件下进行。

溶剂梯度如下：从0到10分钟，B相浓度从10%增加到25%；从10到12分钟，B相浓度从25%增加到60%；从12到14分钟，B相浓度从60%增加到80%；从14到18分钟，B相浓度从80%增加到100%，并保持2分钟；然后在2分钟内返回初始条件，并进行3分钟重新平衡。

实验结果

从定性的角度来看，所得到的代谢谱在所有分析的根样本中都是相似的，无论是品种、采样时间、VWO的耐受水平，还是病原体的存在/缺失，只有在定量水平上存在显著差异。

列出了LC-MS色谱图面积约占95%的31种最丰富的化合物，详见表1。显示了从获得的MS数据和从MassLynx中检索到的用于计算分子式的信息。在可能的情况下，显示了分配给每个色谱峰的化合物的身份，以及对注释的置信程度。

在橄榄根中检测到了几种酚苷化合物，包括羟基酪酸葡萄糖苷和三种异构体的婆罗洲甘露聚糖苷，这是一种咖啡酰基酚乙酸聚糖苷，在其结构中含有羟基酪酸和咖啡酸成分，其身份已通过相应的纯标准得到确认。

至于羟基吲哚苷类化合物，以欧洲橄榄酸、欧洲橄榄次酸和欧洲橄榄酸无葡萄糖苷为代表，化合物已经通过保留时间和MS光谱与其纯标准进行对照，得到确定的注释。该家族的其他化合物则通过色谱和MS数据以及先前关于橄榄组织次生代谢产物的报道进行了注释。

这些化合物包括nuzhenide、二甲基欧洲橄榄次酸、乙酰酸酪酰酸葡萄糖苷、无环二羟基欧洲橄榄次酸葡萄糖苷以及化学式为C16H22O11的化合物，该化合物可以是油苷或荚北花苷。

相关探讨

与其他橄榄源性基质相比，从成分的角度来看，橄榄根的研究很少。因此，在研究中，通过多类LC-MS方法对橄榄植株的根部进行了全面的代谢分析，该方法能够确定属于多种化学类别的代谢物，包括简单酚类、糖苷、木脂素、脂肪酸、五环三萜等。

有9种代谢物通过与其真实标准品进行比较得到了确定的鉴定结果，其中包括一个酚类糖苷、三个木脂素和三个五环三萜。另外，根据相对保留时间、高分辨率质谱和从公共光谱库和先前关于橄榄相关基质的报告中检索到的MS/MS信息，对11个化合物进行了推测性注释。

关于以置信度级别3进行注释的化合物，值得一提的是，以名称为油苷或柚皮苷的化合物在橄榄基质中已被描述过。然而，由于这两种分子是质量异构体，具有非常相似的骨架，并且都与葡萄糖部分结合，无法在没有纯标准品的情况下区分它们。

对于9个“未知”物质，提出了暂定的身份，这些物质是其他植物组织中已被描述为植物化学物质的化合物，具有合理的化学结构，并且属于橄榄相关基质中已存在的化合物家族。因此，根据3.1节中描述的MS/MS数据，将未知物质1归类为弯曲酸二葡糖苷衍生物。

结语

在橄榄根的组成代谢谱与对VWO的耐受水平之间建立了显著的关联。因此，本研究要验证的第一个假设已得到证实：这里研究的橄榄品种的根部代谢谱存在变异性，尽管这种变异性是定量的而不是定性的。

V. dahliae的存在只会引起根部中次生代谢物组分的轻微显著变化。本文要验证的第二个假设也得到了证实：橄榄栽培品种的VWO耐受水平可能与特定化合物的含量差异有关。

这些少数显著变化仅在接种病原体后的早期时间内检测到，这表明了一种基于生物化学的防御反应的快速激活。一方面，实验发现强调了对橄榄根的生化组成的了解的必要性，目的是理解对V. dahliae以及其他土壤传播的病原体的抵抗/耐受机制。

另一方面，所获得的结果可能在育种计划中作为对抗VWO的额外选择标准考虑。

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